ENVIRONMENTAL: Hodnocení účinků environmentálních polutantů na signální dráhy jaderných receptorů. Úzce spolupracujeme s výzkumnými týmy Biofyzikálního ústavu AVČR v Brně a Výzkumného ústavu veterinárního lékařství v Brně. Jako příklad lze uvést dvě recentní studie, publikované v prestižním časopise Environmental Pollution (IF 4,358):

• Vondráček J., Pěnčíková K., Neča J., Ciganek M., Grycová A., Dvořák Z., Machala M. (2017) Assessment of the aryl hydrocarbon receptor-mediated activities of polycyclic aromatic hydrocarbons in a human cell-based reporter gene assay. Environ Pollut 220:307-316.

Jedná se o komparativní studii účinku rozsáhlého souboru environmentálních polutantů ze skupiny polyaromatických uhlovodíků na AhR, s využitím lidské a potkaní reportérové buněčné linie. Zjistili jsme, že rozdíly mezi lidskými a hlodavčími systémy jsou jednak dány mezidruhovými rozdíly v afinitě k AhR receptoru, a rovněž různým metabolickým obratem sledovaných látek. V lidské linii AZ-AHR jsme identifikovali rovněž velmi aktivní frakci polárních chemikálií vázanou na pevné částice ze zplodin z dieselových motorů.

• Pěnčíková K., Svržková L., Strapáčová S., Neča J., Bartoňková I., Dvořák Z., Hýžďalová M., Pivnička J., Pálková L., Lehmler H.J., Li X, Vondráček J., Machala M. (2018) In vitro profiling of toxic effects of prominent environmental lower-chlorinated PCB congeners linked with endocrine disruption and tumor promotion. Environ Pollut 237:473-486.

Popsali jsme účinky nízko molekulárních PCB (low-chlorinated PBB 4, 8, 11, 18, 28, 31) a jejich hydroxylovaných metabolitů na aktivitu jaderných receptorů, hrajících roli v endokrinní disrupci, s využitím širokého panelu buněčných esejí. U většiny kongenerů byly nalezeny anti-androgenní a xeno-estrogenní aktivity, a některé aktivovaly xenosenzory AhR, PXR a CAR. Naopak inaktivní byly LC-PCB v receptorových esejích na VDR, TR, GR a PPARg. Xeno-estrogenní aktivity byly u hydroxylovaných PCB vyšší než u parentních látek. Získané výsledky jsou prioritní, neboť LC-PCB nebyly dosud v tomto kontextu studovány, přestože představují zásadní tzv. indoor a outdoor air pollutants.

FOOD SAFETY: Zaměřujeme se na studium účinků obsahových složek potravin, na signální dráhy jaderných receptorů. V rámci řešení výzkumného projektu Grantové agentury ČR (P503/10/0579) s názvem „Studium interakcí obsahových složek nealkoholických nápojů s regulačními dráhami metabolismu léčiv a karcinogeneze“ jsme popsali účinky extraktů z nealkoholických nápojů, a to ochucených minerálních vod a ledových čajů, na signální dráhy AhR a PXR receptorů (http://napoje.upol.cz/). Data byla publikována v následujících pracích:

• Kamenickova A., Dvorak Z. (2012) Effects of flavoured mineral waters on AhR-CYP1A1 signaling pathway in primary human hepatocytes and in human hepatic and intestinal cancer cells. Food Chem Toxicol 50(6):1933-1939.
• Kamenickova A., Vrzal R., Dvorak Z. (2012) Effects of ready to drink teas on AhR- and PXR-mediated expression of cytochromes P450 CYP1A1 and CYP3A4 in human cancer cell lines and primary human hepatocytes. Food Chem 131:1201-1206.

Rovněž jsme studovali účinky umělých sladidel na signální dráhy AhR a GR, kdy bylo zjištěno, že sacharin, aspartam, cyklamát ani acesulfam s těmito drahami neinterferuje, což bylo přínosem na kontroverzním poli bezpečnosti umělých sladidel:

• Kamenickova A., Pecova M., Bachleda P., Dvorak Z. (2013) Effects of artificial sweeteners on the AhR- and GR-dependent CYP1A1 expression in primary human hepatocytes and human cancer cells. Toxicol In Vitro 27:2283-2288.

V současné době je v laboratoři řešen výzkumný projekt Grantové agentury ČR (17-02718S) s názvem „Interakce esenciálních olejů z kulinářských koření a bylin s endokrinními a detoxikačními signálními drahami“. Provedli jsme rozsáhlou studii účinků 31 různých EO na signální dráhu AhR-CYP1A1, a zjistili jsme, že 16 olejů vykazovalo aktivitu vůči AhR, a to jak plně či parciálně agonistickou, tak antagonistickou:

• Bartoňková I., Dvořák Z. (2018) Essential oils of culinary herbs and spices display agonist and antagonist activities at human aryl hydrocarbon receptor AhR. Food Chem Toxicol 111:374-384.

V současné době se věnujeme detailnímu studiu účinku obsahových složek z AhR-aktivních olejů na signální dráhu AhR v kontextu molekulárních a fyziologických účinků. Rovněž jsme popsali detailně účinky 31 EO na transkripční aktivity jaderných receptorů GR, AR a VDR. Nalezli jsme slabý anti-androgenní a anti-glukokortikoidní účinek EO z vanilky a muškátového oříšku, mírně zesilující účinky na aktivaci VDR kalcitriolem i EO ze zázvoru, tymiánu, citronové trávy a koriandru, a rovněž smíšené anti-GR a pro-VDR účinky olejů z pelyňku, oregana, kopru, kmínu máty a verveine:

• Bartoňková I., Dvořák Z. (2018) Assessment of endocrine disruption potential of essential oils of culinary herbs and spices involving glucocorticoid, androgen and vitamin D receptors. Food & Function 9:2136-2144.

IN VITRO TECHNIQUES: Jelikož se experimentální techniky a in vitro modely v oblasti molekulární farmakologie, toxikologie a biologie dynamicky rozvíjejí, a zároveň existuje specifická potřeba pro individuální výzkumné aktivity, věnuje se Laboratoř molekulární toxikologie a molekulární farmakologie oblasti in vitro technik a modelů, využívaných při studiu jaderných receptorů. Jako první jsme vyvinuli, zavedli a publikovali techniku electromobility shift assay EMSA pro lidský PXR, s využitím neradioaktivních sond; metoda byla popsána v prestižním analyticko-chemickém časopise Electrophoresis:

• Vavrova A., Vrzal R., Dvorak Z. (2013) A non-radioactive electrophoretic mobility shift assay for measurement of pregnane X receptor binding activity to CYP3A4 response element.  Electrophoresis 34:1863-1868.

V rámci řešení výzkumného projektu Grantové agentury ČR (P304/10/0149) s názvem „Konstrukce buněčných modelů odvozených od hepatocytů pro preklinické testování léčiv“ jsme vyvinuli a charakterizovali sérii transgenních buněčných reportérových linií, pro sledování transkripční aktivity AhR a GR. Práce byly publikovány v prestižních časopisech European Journal of Pharmaceutical Sciences a Environmental Science&Technology:

• Novotna A., Pavek P., Dvorak Z. (2011). Novel stably transfected gene reporter human hepatoma cell line for assessment of aryl hydrocarbon receptor transcriptional activity: Construction and characterization. Environ Sci Technol 45:10133-10139.
• Novotna A., Pavek P., Dvorak Z. (2012) Construction and characterization of a reporter gene cell line for assessment of human glucocorticoid receptor activation. Eur J Pharm Sci 47(5):842-847.

V problematice jsme pokračovali v rámci celouniverzitního OPVK projektu postUP, kdy jsme zkonstruovali a publikovali transgenní reportérové linie pro receptory AR a TR:

• Illes P., Brtko J., Dvorak Z. (2015) Development and Characterization of a Human Reporter Cell Line for the Assessment of Thyroid Receptor Transcriptional Activity: A Case of Organotin Endocrine Disruptors.  J Agric Food Chem 63:7074-7083.
• Bartonkova I., Novotna A., Dvorak Z. (2015) Novel stably transfected human reporter cell line AIZ-AR as a tool for an assessment of human androgen receptor transcriptional activity. PLoS ONE 10(3): e0121316.

V současné době je v laboratoři řešen výzkumný projekt Grantové agentury ČR (16-07544S) s názvem „Konstrukce in vitro modelů založených na reportérových buněčných liniích pro toxikologické a environmentální aplikace“, v rámci kterého byla zkonstruována transgenní reportérová linie pro VDR, a v současné době konstruujeme linie pro PPARa a PPARg:

• Bartonkova I., Grycova A., Dvorak Z. (2016) Profiling of vitamin D metabolic intermediates towards VDR using novel stable gene reporter cell lines IZ-VDRE and IZ-CYP24. Chem Res Toxicol 29:1211-1222.

Transgenní reportérové linie vyvinuté v naší laboratoři jsou unikátní tím, že se jedná o lidské buňky, lidský, endogenně exprimovaný receptor a lidský reportér. V současné době byly buněčné linie AZ-AHR, AZ-GR, PZ-TR a AIZ-AR komercionalizovány biotechnologickou společností Applied Biological Materials Inc., Richmond, British Columbia, Kanada:

https://www.abmgood.com/StableCellLines/cellLine-New-dispOne.php?csn=45&catno=T3102

https://www.abmgood.com/StableCellLines/cellLine-New-dispOne.php?csn=45&catno=T3104

https://www.abmgood.com/StableCellLines/cellLine-New-dispOne.php?csn=45&catno=T3103

https://www.abmgood.com/StableCellLines/cellLine-New-dispOne.php?csn=45&catno=T3177

BIO-INORGANIC: Ve spolupráci s Katedrou anorganické chemie PřF UP a oddělením Biologicky aktivní komplexy na Regionálním centru pokročilých technologií a materiálů (RCPTM) se věnujeme oblasti bioanorganické chemie. Kooperace mezi naší laboratoří a RCPTM je vysoce koordinovaná a komplementární, kdy kolegové z RCPTM se zabývají syntézou a strukturní charakterizací potenciálně biologicky aktivních komplexů přechodných kovů, a v naší laboratoři probíhá testování jejich biologické aktivity. Zejména pak sledování cytotoxicity v buněčných liniích, účinku na jaderné receptory a genovou expresi, apoptosy, tvorby reaktivních kyslíkových radikálů, či funkce mitochondriálního aparátu. Spolupráce trvá od roku 2009 a vyústila v publikaci 34 společných prací, např. recentně:

• Štarha P., Trávníček Z., Herchel R., Jewula P., Dvořák Z. (2018) A possible way how to improve in vitro cytotoxicity of halfsandwich Os(II) complexes against A2780 cells. Dalton Trans 47:5714-5724
• Vančo J., Trávníček Z. , Křikavová R., Gáliková J., Dvořák Z., Chalupová M. (2017) Molecular, cellular and pharmacological effects of platinum(II) diiodido complexes containing 9-deazahypoxanthine derivatives: a group of broad-spectrum anticancer active agents. J Photoch Photobio B 173:423-433.
• Kubešová K., Trávníček Z., Dvořák Z. (2016) Pleiotropic effects of gold(I) mixed-ligand complexes of 9-deazahypoxanthine on transcriptional activity of receptors for steroid hormones, nuclear receptors and xenoreceptors in human hepatocytes and cell lines. Eur J Mech Chem 121:530-540.

Bylo přiznáno 8 užitných vzorů, 9 národních patentů a 2 patenty European Patent Office:

• European Patent EP 2636410B1: Bulletin 2015/15: Trávníček Z., Štarha P., Dvořák Z.: Dichlorido complexes of platinum with 7-azaindole halogeno-derivatives for use in the treatment of tumour diseases.
• European Patent EP 260000B1: Bulletin 2017/11: Trávníček Z., Vančo J., Buchtík R., Dvořák Z.: Utilization of copper complexes involving 2-phenyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolinone and 1,10-phenanthroline derivatives for the preparation of drugs for the treatment of tumour diseases.

MOLECULAR MECHANISMS: Výzkumné aktivity Laboratoře molekulární toxikologie a molekulární farmakologie jsou rovněž zaměřeny na studium fundamentálních mechanismů fungování jaderných receptorů a xenosenzorů. V rámci řešení výzkumného projektu Grantové agentury ČR (P303/12/0472) s názvem „Studium mechanizmů regulace biotransformačního enzymu CYP3A4 prostřednictvím posttranslačních modifikací nukleárních receptorů-význam pro terapii“ jsme popsali vliv post-translačních modifikací (fosforylace, acetylace) na transkripční aktivitu a funkci PXR:

• Doricakova A., Novotna A., Vrzal R., Pavek P., Dvorak Z. (2013) The role of residues T248, Y249 and T422 in the function of human pregnane X receptor. Arch Toxicol 87:291-301.
• Pasquel D., Doricakova A., Li H., Kortagere S., Krasowski M.D., Biswas A., Walton W.G., Redinbo M.M., Dvorak Z., Mani S. (2016) Acetylation of Lysine 109 Modulates Pregnane X Receptor DNA Binding and Transcriptional Activity. Biochem Biophys Acta - Gene Regul Mech 1859(9):1155-1169.

DRUGS-XENOBIOTICS: Velmi široké spektrum aktivit zahrnuje studium účinků xenobiotik na xenoprotektivní signální dráhy, což má význam v kontextu fyziologických a patofyziologických dějů, fenoménu drug-drug interactions a food-drug interactions a při detoxikačních procesech. Věnujeme se studiu účinků přírodních látek, obsahových složek potravy, léčiv, syntetických látek a environmentálních chemikálií.

Recentně jsme v laboratoři řešili (2013-2017) výzkumný projekt Grantové agentury ČR (13-018092) s názvem „Enantiospecifické interakce mezi klinicky užívanými chirálními léčivy a regulačními drahami humánních cytochromu P450.“. Řada xenobiotik, včetně léčiv, obsahuje ve své struktuře chirální centrum, a tudíž existuje ve formě dvou nebo více optických izomerů. Optické izomery, jakkoliv jsou chemicky identické, mohou v biologických systémech vykazovat stereoselektivní účinky, což může mít důsledky v účinnosti či vedlejších účincích léčiva. V rámci řešeného projektu jsme sledovali stereoselektivní účinky vybraných, klinicky užívaných léčiv, na signální dráhy AhR a PXR a na katalytickou aktivitu cytochromů P450 metabolizujících xenobiotika. Ze skupiny azolových antimykotik, jsme popsali stereoselektivní účinky cis-enantiomerů ketokonazolu a itrakonazolu na receptory AhR a PXR a expresi a aktivitu jejich cílových genů:

• Novotna A., Korhonova M., Bartonkova I., Soshilov A.A., Denison M.S., Bogdanova K., Kolar M., Bednar P., Dvorak Z. (2014) Enantiospecific effects of ketoconazole on aryl hydrocarbon receptor.  PLoS ONE 9(7):e101832.
• Novotna A., Krasulova K., Bartonkova I., Korhonova M., Bachleda P., Anzenbacher P., Dvorak Z. (2014) Dual effects of ketoconazole cis-enantiomers on CYP3A4 in human hepatocytes and HepG2 cells. PLoS ONE 9(10):e111286.
• Štěpánková M., Pastorková B., Bachleda P., Dvořák Z. (2017) Itraconazole cis-diastereoisomers activate aryl hydrocarbon receptor AhR and pregnane X receptor PXR and induce CYP1A1 in human cell lines and human hepatocytes. Toxicology 383:40-49.
• Krasulová K., Siller M., Holas O., Dvořák Z., Anzenbacher P. (2016) Enantiospecific effects of chiral drugs on cytochrome P450 inhibition in vitro. Xenobiotica 46(4):315-324.
• Krasulová K., Dvořák Z., Anzenbacher P. (2018) In vitro analysis of itraconazole cis-diastereoisomers inhibition of nine cytochrome P450 enzymes: stereoselective inhibition of CYP3A. Xenobiotica (in press)

Popsali jsme rovněž enantiospecifické účinky optických izomerů inhibitorů protonové pumpy, S/R-omeprazolu a S/R-lansoprazolu, na receptory AhR a PXR:

• Novotna A., Dvorak Z. (2014) Omeprazole and lansoprazole enantiomers induce CYP3A4 in human hepatocytes and cell lines via glucocorticoid receptor and pregnane X receptor axis. PLoS ONE 9(8):e105580
• Novotna A., Srovnalova A., Svecarova M., Korhonova M., Bartonkova I., Dvorak Z. (2014) Differential effects of omeprazole and lansoprazole enantiomers on aryl hydrocarbon receptor in human hepatocytes and cell lines. PLoS ONE 9(6):e98711

Optické izomery dihydropyridinových blokátorů kalciového kanálu (benidipin, isradipin, felodipin) byly identifikovány jako duální aktivátory AhR a PXR, ale steroselektivní účinky vykazovaly pouze vůči AhR:

• Štěpánková M., Krasulová K., Dořičáková A., Kurka O., Anzenbacher P., Dvořák Z. (2016) Optical isomers of dihydropyridine calcium channel blockers display enantiospecific effects on the expression and enzyme activities of human xenobiotics-metabolizing cytochromes P450. Toxicol Lett 262:173-186.

Léčiva ze skupiny statinů, využívaná k léčbě vysokých hladin cholesterol, vykazovala stereoselektivní účinky na aktivitu PXR a expresi cílových genů z rodiny CYP2 a CYP3:

• Korhonova M., Doricakova A., Dvorak Z. (2015) Optical isomers of atorvastatin, rosuvastatin and fluvastatin enantiospecifically activate pregnane X receptor PXR and induce CYP2A6, CYP2B6 and CYP3A4 in human hepatocytes. PLoS ONE 10(9):e0137720.

V současnosti řešíme klíčový výzkumný projekt „Centrum interakcí potravních doplňků s léčivy a nutrigenetiky“, financovaný Grantovou agenturou ČR, v rámci Center excelence v základním výzkumu. Jedná se o sedmiletý projekt, řešený od roku 2012. Věnujeme se studiu účinku látek přírodního původu, a látek obsažených v potravinách, na signální dráhy AhR a PXR, v kontextu xenoprotekce a fyziologických a patofyziologických dějů. Intenzivně jsme se věnovali látkám ze skupiny polyfenolů, zejména anthocyanidinů a anthocyaninů, a to jejich účinkům na aktivitu receptorů AhR a PXR a na expresi jejich cílových genů:

• Riha J., Brenner S., Srovnalova A., Klameth L., Dvorak Z., Jager W., Thalhammer T. (2015) Effects of anthocyans on the expression of organic anion transporting polypeptides (OATPs) in primary human hepatocytes.  Food & Function 6(3):772-779.
• Dvorak Z., Srovnalova A., Svecarova M., Vrzal R. (2014) The effect of anthocyans on the expression of selected phase II xenobiotic-metabolizing enzymes in primary cultures of human hepatocytes. Food & Function 5:2145-2151.
• Srovnalova A., Svecarova M., Kopecna-Zapletalova M., Anzenbacher P., Bachleda P., Anzenbacherova E., Dvorak Z. (2014) Effects of anthocyanidins and anthocyanins on the expression and catalytic activities of CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 in primary human hepatocytes and human liver microsomes. J Agric Food Chem 62:789-797.
• Kamenickova A., Anzenbacherova E., Pavek P., Soshilov A.A., Denison M.S., Zapletalova M., Anzenbacher P., Dvorak Z. (2013) Effects of anthocyanins on the AhR-CYP1A1 signaling pathway in human hepatocytes and human cancer cell lines. Toxicol Lett 221(1):1-8.
• Kamenickova A., Anzenbacherova E., Pavek P., Soshilov A.A., Denison M.S., Anzenbacher P., Dvorak Z.  (2013) Pelargonidin activates the AhR and induces CYP1A1 in primary human hepatocytes and human cancer cell lines HepG2 and LS174T. Toxicol Lett 218:253-259.

Další význmanou skupinou látek ze třídy polyfenolů jsou tzv. stilbenoidy (typický představitel je resveratrol), které jsou známe širokou paletou bilogických aktivit. V naší laboratoři jsme popsali účinky hydroxystilbenoidů a methoxystilbenoidů na signální dráhu AhR-CYP1A1:

• Pastorková B. Vrzalová A., Bachleda P., Dvořák Z. (2017) Hydroxystilbenoids and methoxystilbenoids activate human aryl hydrocarbon receptor and induce CYP1A genes in human hepatoma cells and human hepatocytes. Food Chem Toxicol 103:122-132.

Ve spolupráci s Farmaceutickou fakultou UK v Hradci Králové, jsme rovněž popsali účinky stilbenoidů na signální dráhu PXR-CYP3A4 (rukopis v přípravě).

Naše recentní aktivity jsou zaměřeny do oblasti molekulárních účinků metabolitů složek potravy, produkovaných střevním mikrobiomem. Prominentní skupinou takovýchto látek jsou degradační produkty tryptofanu, jako je 3-metylindol, indolyl octová kyselina, indolyl propionová kyselina, indol-3-karbinol a další. Společným znakem metabolitů odvozených od tryptofanu,  je přítomnost indolové kostry ve struktuře těchto látek. Provedli jsme cílenou studii účinku série mono-metylovaných, di-metylovaných, tri-metylovaných, mono-metoxylovaných a di-metoxylovaných indolů, na transkripční aktivitu a funkci lidského AhR. Ukázali jsme, že testované indoly jsou full agonisté, parciální agonisté a antagonisté AhR, se značně variabilními potencemi a účinnostmi. Studie byla provedena ve spolupráci s kolegy z Albert Einstein College of Medicine (New York, USA) a Drexel University – College of Medicine (Pensylvania, USA). Výsledky byly publikovány ve velmi prestižním časopise Molecular Pharmacology, a v současné době pracujeme na tzv. follow-up studiích:

• Štěpánková M., Bartoňková I., Jiskrová E., Vrzal R., Mani S., Kortagere S., Dvořák Z. (2018) Methylindoles and methoxyindoles are agonists and antagonists of human aryl hydrocarbon receptor AhR. Mol Pharmacol 93(6):631-644

1 - Etiologie, diagnostika a charakterizace rostlinných virů a virových metagenomů
2 - Etiologie, diagnostika a epidemiologie fytoplazem

Výzkumný tým laboratoře disponuje potřebným know-how, moderním vybavením a odbornými znalostmi o virových a fytoplazmových chorobách kulturních plodin.

Našim cílem při studiu rostlinných virů je lépe porozumět úloze virů infikujících zejména ovocné dřeviny v kulturním patosystému. Pro jejich objevování, charakterizaci, detekci a analýzu jejich rozmanitosti používáme standardní techniky, jako jsou např. ELISA, RT-PCR, klonování a sekvenování; využíváme i nejnovější přístupy včetně sekvenování nové generace (NGS) jako účinného nástroje pro popis nových virů a pro studium virového metagenomu v populacích rostlin jak v přirozených, tak v kulturních ekosystémech.

Při studiu fytoplazem, patogenů, které osidlují lýko rostlin a způsobují jejich závažné, neléčitelné, choroby, se zaměřujeme na vývoj a aplikace molekulárně diagnostických přístupů založených na analýze bakteriální DNA. K molekulárně epidemiologickým studiím využíváme multilokusovou sekvenační typizaci jak známých, tak nově se vyskytujících fytoplazem. Analyzujeme jednotlivé epidemiologické situace, identifikujeme primární a sekundární rezervoáry fytoplazem, biotické a abiotické faktory ovlivňující jejich šíření, prohlubujeme poznatky o hmyzích vektorech fytoplazem.

Laboratoř je vybavena všemi potřebnými přístroji a zařízeními pro izolace nukleových kyselin, následnou PCR a prováděním agarózových i polyakrylamidových elektroforéz se zaměřením na sekvenační elektroforézy s vysokým rozlišením. Součástí laboratoře je výkonná digestoř pro práci s dráždivými nebo toxickými látkami.

Laboratoř a její vybavení slouží i k výukovým účelům, převážně jsou zde zpracovávány bakalářské a diplomové práce, jichž bylo odvedeno již více než padesát.